上海橋星生物
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| 生物化學主要是研究生物大分子及其相互作用的科學，而生物大分子是存在于生物的基本單元—細胞、細胞間液或體液中的。生物大分子在活細胞內的特定存在條件（pH、離子強度及其他生物大分子的相互制約）下，不僅能保持其結構的完整而且能保持一定的生物活力。研究生物大分子的結構和功能，至今尚未找到一種在細胞內即可進行的方法。因此，人類若想研究生物大分子的結構和功能，從而在分子水平上闡述生命現象的本質，就必須先把生物大分子從細胞或機體內完整、純凈且保持其活力地分離出來。因此，當我們將組織或細胞破碎并在體外（in vitro）分離純化和研究其生物大分子的結構和功能時，就必須時刻注意保持其結構的完整性并維持活力！若想做到這一點，我們就必需從細胞破碎開始（生物大分子馬上失去了其賴以保持活力的制約條件），時刻注意為這些“離體”的生物大分子提供保持結構完整，維持其活力的環境條件。 這種條件不是水、去離子水等能提供的。也就是說，我們要為生物大分子提供一個相對穩定而適宜的pH環境、合適的離子強度及其他外界條件。同樣的，在組織和細胞培養、器官培養等細胞生物學，組織和病理學以及許多生命科學研究的體外培養和體外實驗中，也需要模擬器官、組織和細胞等的生理環境以維持其基本的代謝和生物特性或生命特征。毫無疑問的，在所有這些實驗中，所用液體的基礎溶液都是緩沖液。 緩沖液是溶液中維持溶液pH相對穩定，能“中和”外加酸或堿的化學成分。一般來說，緩沖液是弱酸及其共軛堿（如乙酸和乙酸納）或弱堿及其共軛酸（如氨和氯化銨）組成的溶液，其中的弱酸及其共軛堿或弱堿及其共軛酸則稱緩沖對。 選擇緩沖液的依據是它的pKa值及其化學性質。緩沖液在pH=pKa±1的范圍內是zui有效的。超出這個范圍，無論是還是堿濃度都太小，不能有效抵抗外加酸或堿的影響。而溶液緩沖能力的大小，則取決于緩沖對兩個組分的濃度。選用緩沖液時，還應考慮緩沖液總的離子強度。由于溫度可影響某些弱酸和弱堿的解離，因此也影響pH值。所以配制緩沖液時務必要考慮環境溫度變化對緩沖液pH的影響。 在生命科學研究中，緩沖液的化學性質特別重要。選用緩沖液時不僅要考慮緩沖對的溶解度、穩定性，還要考慮與系統中其它離子或化學成分的相互作用，以及光吸收和對生物系統功能的潛在抑制作用或刺激作用。 使用緩沖液時應注意的一些事項 1.向緩沖液中添加一些必要的穩定劑（如巰基保護劑——乙醇、多元醇、甘油、蔗糖、乙二醇、DDT等），以保護生物大分子重要的活性基團或空間結構。 2.添加金屬離子或絡合劑，以保護對金屬離子敏感（需要或不需要）的生物大分子。有些酶需要兩價的金屬離子（如Ca++,Mg++,Mn++等）作為其輔因子；有些生物大分子則要時刻防范上述酶類（如DNase，Nuclease等）對它們的降解，故要向緩沖液中添加EDTA或EGTA等螯合劑，以保護它們不被降解。 3.添加蛋白酶抑制劑。如我們要研究蛋白質分子，在分離純化他們的過程中，必須時刻防止他們被蛋白酶所水解。為此可向緩沖液中添加PMSF（苯甲基磺酰氟）或DFP（磷酸二異丙基氟），亮抑肽等。它們可分別抑制哺乳動物蛋白酶或絲氨酸蛋白酶的活力。 4.蛋白質添加劑：生物大分子需要有一定的濃度，才能保持其完整的空間構像。因此，經過一系列分離純化步驟而zui終得到純酶制品時，有時其濃度很低。為保持這類濃度很稀的純酶的活力，往往要向這類酶制品（特別是一些商售的限制性核酸內切酶）中人為地添加一些蛋白質，如牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白（Casein）等，從而既保護了目的酶的空間構象又不影響其活力。 5.滲投壓：在組織和細胞的體外培養、保存或洗滌等實驗中，除了溶液的酸堿度，營養成分和與其它離子或化學成分的相互作用外，還要注意液體的滲投壓。低滲可導致溶血或細胞膜破裂，高滲引起細胞皺縮或抑制細胞代謝。有的緩沖對濃度稍高，即可因其與其它離子或化學成分相互作用而影響溶液的穩定性或對細胞的功能產生副作用，因此，為了不使某一緩沖對的濃度過高，可以在同一個溶液中添加多個不同的緩沖系統；為了保持溶液處于等滲狀態，避免高滲或低滲的出現，常通過添加氯化鈉等中性鹽的方法調整溶液的滲投壓，如在磷酸緩沖液（PB）中添加氯化鈉配制成磷酸鹽緩沖液(PBS)。 |
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